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      Y190

      文字:[大][中][小] 2018-1-2    瀏覽次數:3370    

                  Y190 Chemically Competent Cell 產品說明書



       

      產品規格 (CAT#: YC1070)

      Y190 Competent Cell:                                         100μl/支              保存: -80℃(3個月)

      pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl              保存:-80℃(12個月)

      Carrier DNA (5 μg/μl)                                              100μl              保存:-20℃(12個月)

      PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存:    4℃(12個月)


      基因型

      MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trp1-901, leu2-3112, gal4Δgal80Δcyhr2, LYS2 : : GAL1

      UAS-HIS3TATA-HIS3, MEL1 URA3 : : GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ


      產品說明

      Y190菌株是Clontech公司開發的GAL4系統酵母雙雜實驗用菌株,MATa型,可直接轉化質粒或與MATα型酵母菌株Y187通過mating操作進行蛋白互作驗證或篩庫試驗。Transformation marker為: trp1leu2cyh2報告基因為: lacZ,HIS3MEL1。Y190-GAL4酵母雙雜系統需要兩種質粒配套使用:(pGB和pACT2)或(pGBKT7和pGADT7)。質粒pGB由pGBKT7改造而來,篩選標志為TRP1,用于表達DNA-BD(來自酵母轉錄因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)與目標蛋白(Bait)的融合蛋白;質粒pACT2與pGADT7的結構和功能類似,篩選標志為LEU,用于表達AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)與目標蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4系統原理:一個完整的酵母轉錄因子GAL4可分為功能上相互獨立的兩個結構域:位于N端1~174位氨基酸區段的DNA結合域 (DNA-BD)和位于C端768~881位氨基酸區段的轉錄激活域(AD)。DNA-BD能夠識別GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS,并與之結合。而AD可以啟動UAS下游的基因進行轉錄。BD和AD單獨存在不能激活轉錄,但當二者接近時,則呈現完整的GAL4活性,使含有UAS的啟動子下游基因轉錄表達。正常條件下,BD不與AD結合,將要檢測的蛋白質分別與BD和AD融合,形成 bait融合蛋白(bait –BD)和 prey融合蛋白 (prey-AD),如果 bait和 prey發生相互作用,就會促使 BD和 AD的相互接近,形成完整的GAL4,從而激活報告基因的轉錄。Y190感受態細胞經特殊工藝制作,-80℃可保存三個月,pGADT7質粒檢測轉化效率>10cfu/μg DNA。


      操作方法

      1. Carrier DNA 在每次使用前要通過加熱處理使其變性為單鏈狀態,步驟如下:Carrier DNA 放95℃水浴或金屬浴3 min,快速插入冰中,靜置3 min,再次放95℃水浴或金屬浴3 min,快速插入冰中,靜置3 min以上。

      2. 取100 μl冰上融化的Y190感受態細胞,依次加入預冷的目的質粒0.5-3 μg,Carrier DNA10 μl,PEG/LiAc 500 μl并吸打幾次混勻,30℃水浴30 min (15 min時翻轉6-8次混勻)。

      3. 將管放42℃水浴15 min (7.5 min時翻轉6-8次混勻)。

      4. 5000 rpm離心 40 s棄上清,ddH2O 400 μl 重懸,離心 30s棄上清。

      5. ddH2O 50 μl重懸,涂板,29℃培養48-96 h。


      注意事項

      1. 感受態細胞最好在冰上融化。

      2. 轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量。

      3. 同時轉化2-3種質粒時應增加質粒的用量。

      4. Y190酵母菌株對高溫敏感,最適生長溫度為27-30℃;高于31℃,生長速度和轉化效率呈指數下降。

      5. 菌落變粉不是污染,是酵母細胞生長中一個常見現象。當細胞在平板培養幾天后,平板上的Adenine被酵母消耗完畢,酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用,然而,有些菌株的ADE2基因被破壞,Adenine合成途徑受阻;又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中間產物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細胞中積累而使菌落變為粉紅色。

      6. 酵母在缺陷培養基中生長速度比YPDA培養基慢,培養基中缺陷成分越多,生長越慢,以轉化涂板為例:涂YPDA平板29℃,48 h培養可見直徑1 mm克隆;涂SD單缺平板29℃,48-60 h培養可見直徑1 mm克隆,涂SD雙缺平板29℃,60-80 h培養可見直徑1 mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90h培養可見直徑1 mm克隆。


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